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高二生物集体备课-选一-专题5 DNA和蛋白质技术课题1 DNA的粗提取与鉴定

[日期:2012-06-24]   来源:生物百花园  作者:生物百花园   阅读:403[字体: ]

DNA和蛋白质技术,包括DNA的提取、蛋白质的提取、DNA片段的扩增等,是开展分子生物学研究的基本技术。本专题将从基础入手,学习DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术,不仅能够帮助学生初步了解分子生物学的基本实验方法,而且能够巩固必修课中学习的有关DNA和蛋白质的理论知识。
专题分析
一、 教学目的要求
本专题三个课题均依照课程标准中的具体内容标准编排,其对应关系如下表。其中,课题1“DNA的粗提取与鉴定”在课程标准中没有明确要求,但考虑到不少学校都曾做过DNA的粗提取的实验,并且DNA的提取与蛋白质的提取相比,难度较低、成功率较高,因此安排了课题1“DNA的粗提取与鉴定”。
具体内容标准 对应课题
尝试蛋白质的提取和分离 课题3
尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作和应用 课题2
在本专题的学习中,学生需要了解提取生物大分子的基本思路和方法,尝试DNA和蛋白质的提取。学生应当理解PCR扩增DNA片段的原理,尝试PCR技术的基本操作和应用。
二、技术要项
本专题围绕DNA和蛋白质技术展开,主要操作技术归纳如下。
1.DNA的粗提取和鉴定。
2.PCR技术。
3.血红蛋白的提取和分离技术。
三、设备条件
本专题课题1并不需要特殊的实验用具或器材。课题2需要PCR仪及PCR试剂盒,PCR仪也可以用3个恒温水浴锅代替。课题3需要色谱柱、交联葡聚糖凝胶G-75、离心机、缓冲液等提取蛋白质的常规设备和材料用具。
四、教学安排
本专题的3个课题相对独立,没有严格的先后顺序。课题1的操作难度不高,学生比较容易获得结果,2课时就能够完成。课题2的操作难度也不高,但对PCR原理的理解是教学中的难点。教学中,教师要充分利用教材的图文资料,化解这一难点,然后再引导学生进行实验操作。课题3的操作难度比较大,建议教师做好预实验,摸索成功的经验,然后再进行教学。由于蛋白质的分离需要一定的时间,因此教师还要调动学生,充分利用课余时间。
参考书目
1.分子克隆实验指南(第三版)。[美]J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著。科学出版社,2002。
2.生物化学实验原理和方法。李建武等编写。北京大学出版社,1994。
3.生化技术导论。中山大学生物系微生物学教研室编写。人民教育出版社,1978。

 

 

 

课题1 DNA的粗提取与鉴定

一、课题目标
本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取,了解DNA的物理化学性质,理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
二、课题重点与难点
课题重点:DNA的粗提取和鉴定方法。
课题难点:DNA的粗提取和鉴定方法。
三、课题背景分析
生物体的性状之所以能够遗传给后代,是由于生物体内具有DNA或RNA这些遗传物质。通过必修2《遗传与进化》的学习,学生已经学习了证明DNA是主要的遗传物质的实验证据。那么DNA究竟是什么样的呢?本课题通过实验操作,使学生对DNA有一定的感性认识。
四、基础知识分析与教学建议
知识要点:1.DNA的物理化学性质,尤其是DNA的溶解性;2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。
教学建议
1.在教学过程中,教师要引导学生分析插图5-1“DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线”,使学生理解:在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时,DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低;在0.14 mol/L时,DNA溶解度最小;当NaCl溶液浓度继续增加时,DNA的溶解度又逐渐增大。利用上述原理,可以将DNA溶于高浓度的NaCl溶液中,使其与其他物质分开。
2.教师要注意引导学生认识DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性的不同。教材在实验设计中关于去除滤液中杂质的第二、第三个方案,正是利用了上述不同的特性,从而达到分离DNA和蛋白质的目的。
3.教材中介绍了用二苯胺法鉴定DNA的方法,教师可以引导学生结合教材中的资料,利用所学的知识,采用其他的方法鉴定DNA,如电泳法、紫外灯照射法等。
五、实验案例
案例一 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取
课前准备
本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富,材料易得;二是鸡血细胞极易吸水胀破,而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心,对设备要求较高,操作繁琐,历时较长。
教师可以到市场售活鸡处索取鸡血,所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL,置于500 mL烧杯中,注入新鲜的鸡血(约180 mL),同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内,静置1 d,使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心,用2 000 r/min或3 000 r/min的转速,离心2 min,使血细胞沉淀于离心管底部,这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。
提取DNA的具体步骤
1.破碎细胞,释放DNA
鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合,位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来,需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水,并且搅拌,从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌,但也不能太快太猛,防止打碎DNA。一般5~10 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起,应用3~4层纱布进行过滤,除去一些颗粒较大的杂质。
2.溶解细胞核内的DNA
在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚,游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液,搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌,使DNA充分溶解。
3.DNA的析出
将溶液中的DNA与其他杂质分离,这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA的三种方案,本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度,使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水,并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌,以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量,使NaCl溶液的终浓度为0.1~0.2 mol/L。加水过程一般分三次进行,当总加水量为300 mL左右时,DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀,会使DNA分子又重新溶解。
用3~4层纱布对DNA稀释液进行过滤,滤去蛋白质,收集DNA的黏稠物。如果采用离心法,效果更好。用4 000 r/min转速的离心机,离心15 min,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。
4.DNA的初步纯化
如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质,或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范,都会导致实验现象不明显,常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果,需要对DNA粗制品进行简单的提纯,下面的方案可供参考。
将DNA黏稠物再溶解,继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物,仍旧沿一个方向不停搅拌3 min,使DNA充分溶解,以免损失。用3~4层纱布进行过滤(或离心),滤去杂质,收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95%的乙醇,并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌,溶液中会出现DNA丝状物。
实验一般要求采用预冷的95%的乙醇,但对比结果显示,常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。从理论上分析,预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。此时悬浮于溶液中的DNA丝状物相对含杂质较少,如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。如果DNA丝状物较少,不易吸附在玻璃棒上,也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。
DNA的纯化还有许多其他方法。例如,添加质量分数为25%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,使蛋白质变性后与DNA分开。随后,加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1),通过离心将蛋白质及其他杂质除去,取上清液。可重复上述操作几次,直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性,抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后,离心分层,DNA溶于上层水相,蛋白质变性存在于酚层中,这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。教师可以根据学校的条件让学生自己设计实验方案,比较实验结果。
5.DNA的鉴定
二苯胺法二苯胺试剂的配制及鉴定DNA的方法参见教科书。需要注意的是,二苯胺试剂在冰箱内可保存6个月,使用前需摇匀。
紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液,将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。
电泳法此方法适合鉴定纯度较高的DNA。有条件的学校可以参考本专题课题2的实验案例和参考资料部分。
案例二 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取
课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95%的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h。
提取DNA的具体步骤
1.取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
2.研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min。
研磨液的配制方法如下。将10.1 g Tris加入到50 mL蒸馏水中,使其溶解,然后,用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0,再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。
教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂,使植物细胞膜破碎,释放DNA。学生可以设置对照实验,比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂──十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液,使细胞膜破碎,同时将DNA与植物中多糖等杂质分开,再用氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1)抽提去除杂质蛋白,得到高纯度的DNA。
3.过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1000 r/min的转速,离心2~5 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。
4.沉淀 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的预冷乙醇溶液中,并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3~5 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,将絮状物缠绕在玻璃棒上。
六、课题成果评价
(一)是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色,如果不是白色丝状物,说明DNA中的杂质较多;二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功,如果不呈现蓝色,可能所提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误,需要重新制备。
(二)分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
(三)不同实验方法的比较
对于不同的实验方法,本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料,其次同种材料还可以采用不同方法,从多方面比较实验结果,如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等,看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
七、答案和提示
(一)旁栏思考题
1.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
答:蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA。
2.加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?
答:洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。
3.如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?
答:研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4.此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?
答:可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5.为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?
答:用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6.方案二与方案三的原理有什么不同?
答:方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离。
(二)练习
1.答:提取DNA的第一步是材料的选取,其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料,否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难;第二步是DNA的释放和溶解,这一步是实验成功与否的关键,要尽可能使细胞内的DNA全部溶解;第三步是DNA的纯化,即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性,最大限度地将DNA与杂质分开;最后一步是对DNA进行鉴定,这是对整个实验的结果的检测。
2.答:提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为,与DNA相比,蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多,很容易失活;并且蛋白质的空间结构多种多样,理化性质各不相同,使得蛋白质的提取没有一种统一的方法,只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件,设计特定的方法。
八、参考资料
1.二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
2.研磨液中几种药品的作用
Tris/HCl:提供缓冲体系,DNA在这一体系中呈稳定态(Tris为三羟甲基氨基甲烷)。
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):是DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
SDS(十二烷基磺酸钠):可以使蛋白质变性,与DNA分离。
 


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