主题：为什么传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了？

最近，有老师打电话来询问关于细胞培养的一些问题，现就这些问题作一答复。

1．原代培养和传代培养的概念

从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1:2～1:4的比例传代。但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。

传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3～6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。

2．关于传代培养

在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。一般细胞每毫升接种数量为5×10⁴～8×10⁵个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。

3．关于CO₂培养箱

细胞培养中所用的培养箱一般称为CO₂培养箱，它的气体环境是95%的空气和5%的CO₂。由于某些资料中误把“空气”写成“氧气”，导致很多教师有疑问，不停地来信来电询问。CO₂既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养液的pH有直接关系。动物细胞多数需要微碱性环境，pH为7.2～7.4，以不超出6.8～7.6为宜。在细胞培养过程中，随着CO₂释放量的增多，培养基会变酸，因此常加入NaHCO₃（与CO₂溶于水后所形成的H₂CO₃构成一个缓冲对）来调节pH。NaHCO₃具有释放CO₂的倾向，加入CO₂可以抑制这个反应的进行。培养箱中CO₂浓度应与培养液中NaHCO₃浓度相平衡，如果培养箱中CO₂浓度设定在5%，培养液中NaHCO₃的加入量应为1.97 g/L；如果CO₂浓度维持在10%，则NaHCO₃的加入量应为3.95 g/L。

还有老师问到，如果气体环境改为95%氧气和5%的CO₂，行不行？显然是不行的。氧气是一种氧化剂，浓度太高，会损伤细胞的。在有些细胞培养中，还需要加入抗氧化剂如巯基乙醇等。