9.7 微生物的形态观察
中学生培养微生物，最终目的是要对它们的菌落和菌体的形态进行观察。微生物（尤其是细菌）由于体型特别微小，形态观察工作难度较大，必须反复练习和认真操作方能掌握。
一、细菌的染色和形态观察
1.细菌的染色
细菌的菌体很小，而且大都是无色透明，为了在显微镜下看清其形态，需要进行染色。细菌染色的方法很多，主要有单染色法和革兰氏染色法两种，现分述如下。
(1)单染色法。单染色法可用于观察细菌的一般形态，其步骤为：涂片→固定→染色→冲洗→干燥→观察。
涂片 在干净的载玻片的中央部位，滴一滴无菌水，然后以无菌操作方法，从斜面培养基上取出少量菌种，在载片上与水混合后，涂成均匀的菌掖，涂布面积不宜过大。
固定 将载玻片在酒精灯火焰上迅速通过2～3次，使菌液干燥，将菌体固定在载玻片上，使其不易脱落。
染色 取结晶紫染色液（或番红染色液、美蓝染色液），滴加在干燥的涂片上，滴加量以染液刚能覆盖涂片部分为适宜。染色1分钟。
冲洗 用自来水轻轻冲去染液，直至流水变清为止。
干燥 用吸水纸吸去载玻片上的水或在微火上烘干。
镜检 在显微镜油镜头下观察细菌的菌体形态。
(2)革兰氏染色法。革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态，而且它还是细菌鉴定的重要方法，它可将全部细菌区分别革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。革兰氏染色法的步骤为：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察。
涂片 与单染色法相同。
固定 与单染色法相同。
结晶紫染色 染色1分钟，然后水洗并用吸水纸吸干。
碘液媒染 染色1分钟，然后水洗并吸干。
酒精脱色 用95%酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止（大约半分钟），然后立即水洗，并吸干。
番红复染 染色3分钟左右，然后水洗并吸干。
镜检 在显微镜油镜头下观察，菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌；菌体显红色的为革兰氏阴性菌。
2.显微镜油镜头的使用方法
观察细菌菌体形态，在染色后，通常须使用油镜头方能观察清楚。
油镜头正式名称是油浸接物镜。它与其它物镜不同之处，是在使用时，载玻片与物镜之间不是空气，而是充满香柏油一类的油质。从而提高了显微镜的放大效能。使用油镜头与一般接物镜不同之处，主要有以下3点：
(1)使用时滴加镜油。具体作法是用粗调上提镜筒约2厘米，将油镜头转至正下方，对准通光孔。在载玻片上标本的观察部位，滴加镜油1滴（用香柏油或液体石蜡）。然后用肉眼从侧面注视，使用粗调慢慢将镜筒向下旋转，直至油镜头浸入油滴，并几乎与标本接触。镜筒向下旋转时，必须小心谨慎，切不可将油镜头压到标本上，以免损坏镜头和压碎标本。
(2)调节焦距。从接目镜内注视视野，用粗调将镜筒慢慢上提，当视野中出现模糊的标本形象时，改用细调继续调节焦距，直至物象清晰为止。如果油镜头已离开油面仍未见到物象，应重新按上述步骤操作。
(3)使用后擦拭镜头。油镜头使用后，必须用擦镜纸将镜头上的油擦去，然后再用擦镜纸沾一点二甲苯擦拭镜头，最后用擦镜纸擦干。若用液体石蜡则可免去使用二甲苯这一步骤，直接用擦镜纸擦拭镜头即可。
3.细菌形态观察
(1)菌落观察。观察不同细菌生成菌落的形态特点。观察内容主要有大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，菌落的大小可量取其直径；形状指圆形或不规则形等；表面指凸起或平展、有无光泽以及是否光滑等；质地指粘、脆而言，可用接种针挑取菌落，试验是否容易挑取。
(2)个体形态观察。将菌种进行革兰氏染色，然后在显微镜油镜头下观察。观察内容主要有以下3个方面：
①区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；
②观察细菌的形状（如球形、杆形、螺旋形等）；
③菌体排列方式。
二、放线菌的形态观察
1.菌落形态观察
(1)挑取泾阳链霉菌（“5406”放线菌）的少量孢子丝，点种于高氏一号培养基上，于37℃下培养3～5天。
(2)观察菌落形态。注意菌落的形状、质地、颜色、表面及背面特征以及菌落的牢固程度等。
2.孢子丝形态观察
①将熔化的高氏一号培养基，倒入甲、乙两个无菌培养皿中。甲皿倒入15毫升，乙皿倒入5毫升，平置凝固待用。
②将盖玻片斜插在甲皿中的培养基上（每皿可插6片）。
③用小刀将乙皿中的培养基切成边长为3毫米左右的小方块。
④用接种铲铲取乙皿中的培养基小块，放在甲皿的盖玻片上，培养基小块的下方应与甲皿培养基接触。
⑤在盖玻片的培养基上接种少量放线菌菌种，于37℃下培养5天左右。
⑥取出带有培养基的盖玻片，在显微镜下观察，注意基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形状。
3.孢子形状观察
①取1盖玻片，在单菌落表面轻轻按压，使孢子贴附在盖玻片上。
②取1载玻片，在其中部滴加1滴美蓝染色液。
③将盖玻片带有孢子一面朝下，盖在载玻片的染色液上，用吸水纸吸去多余染色液。置于显微镜下，观察孢子形状和断裂方式。
三、霉菌的形态观察
1.菌落观察
①将配制好的马铃薯蔗糖培养基倒入培养皿内，凝成平板，待用。
②分别将青霉、曲霉、根霉和毛霉点种于上述培养基上，放置25～28℃下培养5～10天，形成菌落。
③观察上述各种霉菌菌落的大小、形状、颜色、质地及渗出物特点等。注意霉菌菌落与细菌、放线菌、酵母菌菌落的区别。
2.菌丝体和孢子形态观察
①挑取青霉或曲霉的菌丝体，置于滴有乳酸石炭酸液的载玻片上，加盖盖玻片，制作临时装片，在高倍镜下观察菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（应辨认分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子）。
②挑取根霉或毛霉的菌丝体，按上述观察青霉的方法，制作临时装片，在高倍镜下观察菌丝不分隔的特点，并观察孢子囊柄、孢子囊和孢囊孢子的形态。
四、酵母菌的形态观察
1.菌落观察
①取啤酒酵母、假酵母菌以三点点植法接种于麦芽汁平板培养基上，置于28～30℃下培养3天，形成菌落。
②观察菌落表面、高度、边缘、质地和颜色等方面的特点。
2.观察出芽生殖
①在载玻片上滴1滴蒸馏水，挑取少量啤酒酵母放入蒸馏水中，盖好盖玻片，制成临时装片（注意不要产生气泡）。
②观察菌体细胞的大小与出芽方式。
3.观察子囊孢子
①将面包酵母接种于麦芽汁液体培养基中，于28～30℃下培养24小时，然后连续传代3～4次，最后转接到肉汁蛋白胨培养基上，在25～28℃下培养3天左右。使其形成子囊孢子。
②从形成子囊孢子的菌落中，取出少量菌体，在载玻片上制作涂片，干燥、固定后，在涂菌处滴上5%孔雀绿染液（尽量多滴一些，不使干燥），10分钟后，用水冲洗，再用0.5%番红染液复染1分钟。
③将涂片置于显微镜下，观察子囊孢子的形状、特点，注意每1个子囊内的孢子数目。